Al quedar viuda, su hermano Felipe II de España la reclamó para darle el cometido de Gobernadora del Reino.En una capilla del claustro alto colgó durante siglos La Anunciación de Fra Angélico, famoso retablo que en 1862 fue trasladado al Museo del Prado, tras largas gestiones realizadas por Federico de Madrazo, que además de pintor fue durante muchos años director del museo.

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Antonio y Luis González Velázquez pintaron la bóveda que más tarde se quemó en el incendio de 1862.El aspecto arquitectónico de su interior, sin embargo, corresponde a la remodelación llevada a cabo a mediados del siglo xviii por Diego de Villanueva.Otra dedicada al marqués de Pontejos ( Joaquín Vizcaíno obra de Medardo Sanmartí.

En esta capilla se guardaba la tabla de la Virgen del Milagro de Paolo de San Leocadio que se encuentra en la actualidad en el altar mayor de la iglesia.Doña Margarita de Austria (Nápoles,.En las esquinas hay cuatro altares con pinturas sobre tabla de Diego de Urbina, que se sabe fueron pagados al pintor madrileño en 1586.